DNA片段的连接技术

实验十三 DNA片段的连接技术
一、目的与原理
DNA酶切片段的联接是两DNA片段相邻的5‘磷酸和3’羟基间可有连接酶催化形成磷酸二酯键,这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)DNA连接酶和T4DNA连接酶催化,但是分子生物学试验中主要采用T4DNA连接酶,因该酶在正常条件下,即能完成连接反应。本实验拟通过T4DNA连接酶对酶切片断的连接操作,掌握这一DNA片段的连接技术。
二、材料和方法
1. 仪器
离心机,恒温设备,真空干燥机,取液器
2. 试剂
T4DNA连接酶,10×T4DNA连接酶缓冲液、200mM Tris-HCl(pH7.6)、50mM MgCl2、50mM DTT、500μg/ml牛血清白蛋白、5mM ATP、λDNA、酚,TE缓冲液,电泳缓冲液、3M NaAc
三、操作步骤
取干净、灭菌新Eppendorf管,按下表加入各试液
试液 体积(μl)
T4DNA连接酶缓冲液 1.5
λDNA 10
ATP 1
无菌水 1.5
连接酶 1
总体积 15
19–20℃ 保温2小时,提取已连接好的DNA片段。电泳分析。
四、结果 (略)
五、注意事项
1、 该实验用的T4DNA连接酶最适反应是37℃,但该温度下DNA退火效率低,连接效率还不如22℃高。
2、 如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效,可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功,则说明有效。
实验十四 受体菌感受态细胞的制备
一、目的与原理
当细菌处于容易吸收外源DNA的状态时,即为感受态,而用理化手段使细菌处于感受态的操作为致敏过程。感受态细胞制备是重组基因能否实现转化的一个重要的技术环节。本试验是通过钙离子来诱导使之成为感受态细胞。
二、材料和方法
1. 材料:大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)
2. 仪器:
离心机,恒温摇床,恒温水浴,超净工作台,冰柜
3. 试剂
LB培养基,0.1M MgCl2,3mM氯化六氮合高钴
TFB:10Mm MES(pH6.3)
45Mm MnCl2
10Mm CaCl2
10Mm KCl
三、操作步骤
大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)在LB培养基平板上划线培养12-16小时,挑取单菌落于LB培养基摇瓶培养大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)到对数期。取1ml培养物7000rpm,离心3min,收集菌体。再重复一次。冰浴放置。用预冷的氯化镁悬浮菌体7000rpm离心3min。收集菌体,冰浴放置。用预冷的氯化钙悬浮菌体,冰浴15min, 7000rpm离心3min。收集菌体,冰浴放置。加入200μl预冷的氯化钙(或TFB),放置于冰浴,即得感受态细胞,此细胞可现用,也可进行下步操作。将悬液分装于无菌离心管中,投入液氮,然后储于-70℃保存。
四、结果 (略)
五、注意事项
一般地,新制备的感受态细胞48h后转化效率降低,15d后失效。因此,感受态细胞不能保存太久,4℃保存一周,但-80℃可保存1年。用试管分装可避免反复冻熔,损伤感受态细胞。
实验十五 重组片段的转化及克隆和筛选
一、目的与原理
转化是指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转化技术在基因工程(Genetic Engineering)(Genetic Engineering)(Genetic Engineering)(Genetic Engineering)领域中占有极重要的地位。目前用得较多的转化技术为将人工构建的重组质粒到如受体细胞,使重组质粒在受体细胞中稳定地复制和表达。
二、材料和方法
1.材料:大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)
2.仪器:
离心机,恒温摇床,恒温水浴,超净工作台,冰柜
3.试剂
LB培养基; 0.1M mM CaCl2 ; 0.1M MgCl2 ;
TFB:10mM MES(pH 6.3),45mM MnCl2, 10mM CaCl2, 100mM KCl
三、操作步骤
1. 感受态细胞融化(在手心)
2. 加入溶于TE的待转化外源DNA,冰浴30min。
3. 42℃热冲击2 min。
4. 冰上2min。
5. 加入0.4 ml LB液体培养基,37℃保温摇床45 min
6. 取0.2ml菌悬液涂布在含氨苄青霉素、IPTG、X-gal培养基上,37℃培养。
四、实验结果及分析:
培养皿上有白色菌落和兰 色菌落,但兰色菌落数量很少。由于受体细胞本身的菌落为兰色,所以白色菌落说明转化成功;兰色应为转化不成功。但是由于转化的质粒经过了酶切和连接,若是在原酶切位点的连接进行的转化,菌落为白色;若为酶切去一段DNA的的连接质粒进行的转化,菌落为兰色(说明在酶切上成功,连接上也成功,转化上也成功)。
五、注意事项
关键要严格控制热激时间,超过2min,则转化会失败。
免疫学实验
实验十六 单向琼脂扩散实验
一、原理
单向琼脂扩散实验又称单向免疫扩散实验。指可溶性抗原在相应抗体的琼脂介质中的扩散,可定性、定量抗原。
二、操作步骤
1.取一块干净的玻璃板,用少量75%乙醇冲洗,晾干后置于水平台,将1%琼脂糖融化,56℃水浴中保温。
2.取15ml琼脂糖加到56℃预热玻璃管中,加入约200微升抗血清,充分混匀后铺于玻璃板上,厚度约为1㎜。
3.待凝胶凝固后打孔,直径为3㎜,将孔内琼脂弄出。
4.将系列稀释的标准抗原和待检抗原分别加到凝胶孔内,每孔5微升。
将凝胶板置于湿盒内,室温过夜,观察结果。
三、实验结果
发现沉淀环的大小与抗原的浓度成反比,基本成线性相关。其大小不仅与孔中抗原的浓度相关,而且和琼脂中抗体的浓度有关。
实验十七 双向琼脂扩散实验
一、原理
双向琼脂扩散实验,是将抗原和相应抗体分别加入同一凝胶板内的相邻小孔中。两者相互扩散,当扩散到他们的浓度比例合适的部位相遇时,就会形成抗原抗体复合物的沉淀。
二、操作步骤
1.取一块干净的玻璃板,用少量75%乙醇冲洗,晾干后置于水平台,将1%琼脂糖融化,56℃水浴中保温。
2.将琼脂糖铺于玻璃板上,厚度约为1㎜。
3.打孔,孔距为4㎜,
4.将抗血清按二倍稀释法稀释成1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32的不同浓度。
在周围孔中加入不同浓度的抗体,中心孔加抗原。
将凝胶板置于湿盒内,室温过夜,观察结果
三、实验结果
浓度不同,形成不同的沉淀的线。
实验十八 免疫电泳
一、操作步骤
1.取一块干净的玻璃板,用少量75%乙醇冲洗,晾干后置于水平台,将1%琼脂糖融化,56℃水浴中保温。
2.将琼脂糖铺于玻璃板上,厚度约为1㎜。凝固后,打孔。
3.在孔内加入抗原,其中一孔内加电泳指示剂。
4.将凝胶板放在电泳槽中进行电泳,确定电泳时间。
5.电泳后在凝胶板上沿电泳方向平行挖2㎜宽的长槽,加入抗血清。
二、实验结果
将凝胶板放入湿盒,室温放置12小时,可观察在到沉淀弧线。
实验十九 对流免疫电泳
一、操作步骤
1.1%琼脂糖融化后,置于56℃备用。
2.取一块干净的玻璃板,用少量75%乙醇冲洗,凉干。
3.将琼脂糖铺于玻璃板上,厚度约为1㎜。凝固后,打孔。
4.在孔内分别加入抗原和抗体,每孔5微升,抗体点阳极,抗原点阴极。
5.在电场中电泳50min,5V。
二、实验结果
在小孔中间出现沉淀线。
实验二十 火箭免疫电泳
一、操作步骤
1.取一块干净的玻璃板,用少量75%乙醇冲洗,晾干后置于水平台。
3%琼脂糖融化后,置于56℃备用。
2.将琼脂糖铺于玻璃板上,厚度约为1㎜。凝固后,打孔。
3.将抗原按倍比稀释,在孔内分别加入标准抗原和代测样品,每孔5微升。
在10V电场中电泳3小时。
二、实验结果
发现在电泳方向上有拖尾,拖尾长度与抗原浓度有关。

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