Phos-tag? 系列磷酸化蛋白新方法

Phos-tag? 系列磷酸化蛋白新方法

英??文??名:?Phos-tag??Acrylamide AAL-107 5mM Aqueous Solution

产  地:?日本

商  家:?Wako(和光纯药工业株式会社)

wao Phos-tag?实验设计

◆? 研究领域

磷酸化蛋白和磷酸化多肽的研究

◆? Phos-tagTM?的简介

Phos-tagTM(Phosphate-binding tag)是由日本广岛大学的Kinoshita等研制的磷酸化蛋白蛋白捕获分子。Phos-tagTM?螯合Zn2+或者Mn2+等重金属离子后形成一个半封闭的空间。在pH值6~8的中性条件下,该空间恰好能容纳一个磷酸基团,使得螯合有金属离子的Phos-tagTM?分子能够与磷酸基团牢固而稳定的结合。可以特异性结合所有氨基酸的磷酸化基团,广泛运用于细菌,酵母,昆虫等物种研究。

◆? Phos-tagTM?系列产品

利用螯合有金属离子的Phos-tagTM?可以特异性结合磷酸化基团的特点,研发了Phos-tagTM?系列产品,运用于常见的蛋白实验,比如SDS-PAGE,免疫印迹,亲和层析,质谱等。

Phos-tagTM?系列产品 产品描述 用途 具体运用实验
Phos-tagTM?? Acrylamide Phos-tagTM?与丙烯酰胺(Acrylamide,SDS-PAGE分离胶主要成分)结合 分离磷酸化和非磷酸化蛋白。SDS-PAGE分离胶制备中添加金属离子(Zn2+或者Mn2+)和Phos-tagTM?Acrylamide。在蛋白电泳过程中,磷酸化基团与金属离子螯合的Phos-tagTM?Acrylamide发生特异性结合,导致磷酸化蛋白的迁移速度变慢。 SDS-PAGE(单一蛋白)

免疫印迹(多种蛋白混合液,例如细胞裂解液,组织均浆液,体外激酶反应体系。使用目的蛋白的非磷酸化抗体作为一抗)

Phos-tagTM?Biotin Phos-tagTM?与生物素(Biotin)结合 可与亲和素标记的HRP结合,检测磷酸化蛋白。 免疫印迹(正常SDS-PAGE)
Phos-tagTM??Agarose Phos-tagTM?与琼脂糖(Agarose)结合 利用磷酸化基团与金属离子螯合的Phos-tagTM?Agarose特异性结合,纯化磷酸化蛋白。 亲和层析法
Phos-tagTM?Mass Analytical kit Phos-tagTM?与不同荷质比的Zn结合 检测微量磷酸化蛋白和磷酸化多肽。 质谱实验

备注:除Phos-tagTM?Mass Analytical kit之外,其他Phos-tagTM?系列产品都需要配置金属离子溶液。

Phos-tag? 系列磷酸化蛋白新方法!
Phos-tag? 是一种能与磷酸离子特异性结合的功能性分子。它可用于磷酸化蛋白的分离(Phos-tag? Acrylamide)、Western Blot检测(Phos-tag? Biotin)、蛋白纯化 (Phos-tag? Agarose)及质谱分析MALDI-TOF/MS (Phos-tag? Mass Analytical Kit)。

◆Phos-tag? 的基本结构

特点
与-2价磷酸根离子的亲和性和选择性高于其它阴离子
在pH 5-8的生理环境下生成稳定的复合物

◆原理

◆应用

样品类型:?纯化蛋白、组织均浆液、组织裂解液、体外酶反应液
样品来源物种:?无物种特异性,可用于人、植物(拟南芥 水稻 棉花等)、动物(斑马鱼 灵长类等)、微生物(酵母 细菌 真菌等) 昆虫(果蝇 蚕等)
分离蛋白大小:?磷酸化蛋白的分离范围在十几到220kDa,文献报道可分离350kDa的磷酸化蛋白
准备的试剂和仪器:?10mM的MnCl2溶液,固体产品需要溶解于甲醇中,其余与常规SDS-PAGE相同
各包装可做实验次数:?2mg包装20μM可制约20块胶,50μM约8块;10mg包装20μM可制100块胶,50μM约40块
凝胶染色:?考马斯亮蓝、银染、荧光染色、阴性染色

相关产品

产品名称 用  途
 Phos-tag? Acrylamide  分离: SDS – PAGE 分离不同磷酸化水平的蛋白
 SuperSep Phos-tag?  分离: 预制胶中含有50μM Phos-tag? Acrylamide
 Phos-tag? Biotin  检测: 代替 Western Blot 检测中的磷酸化抗体
 Phos-tag? Agarose  纯化: 通用柱层析,纯化磷酸化蛋白
 Phos-tag? Mass
Analytical Kit
 分析: 用于质谱 MALDI-TOF/MS 分析,提高磷酸化分子的检测灵敏度

?

Phos-tag Acrylamide(丙烯酰胺)

产品编号 生产商编号 产品名称 规格 Phos-tag在配制胶中的浓度
20μM 50μM 100μM
304-93526 AAL-107S1 Phos-tag? Acrylamide AAL-107 5mM Aqueous Solution 0.3mL 约10块 约4块 约2块
300-93523 AAL-107M Phos-tag? Acrylamide AAL-107 2mg 约20块 约8块 约4块
304-93521 AAL-107 Phos-tag? Acrylamide AAL-107 10mg 约100块 约40块 约20块

?

SuperSep?Phos-tag??(丙烯酰胺预制胶)

产品编号 产品名称 产品规格
193-16711 SuperSep?Phos-tag??(50?μmol/L),?10%,?13?well
Phos-tag?13孔10%预制胶
5块
190-16721 SuperSep?Phos-tag??(50?μmol/L),?10%,?17?well
Phos-tag?17孔10%预制胶
5块
195-16391 SuperSep?Phos-tag??(50?μmol/L),?12.5%,?13?well
Phos-tag?13孔12.5%预制胶
5块
193-16571 SuperSep?Phos-tag??(50?μmol/L),?12.5%,?17?well
Phos-tag?17孔12.5%预制胶
5块
193-16691 SuperSep?Phos-tag??(50?μmol/L),?15%,?13?well
Phos-tag?13孔15%预制胶
5块
196-16701 SuperSep?Phos-tag??(50?μmol/L),?15%,?17?well
Phos-tag?17孔15%预制胶
5块
197-16851 SuperSep?Phos-tag??(50?μmol/L),?17.5%,?13?well
Phos-tag?13孔17.5%预制胶
5块
194-16861 SuperSep?Phos-tag??(50?μmol/L),?17.5%,?17?well
Phos-tag?17孔17.5%预制胶
5块
198-17981 SuperSep??Phos-tag??(50μmol/l),?7.5%,?17well,?83×100×3.9mm
Phos-tag??预制胶,BioRad型
5块
195-17991 SuperSep??Phos-tag??(50μmol/l),?12.5%,?17well,?83×100×3.9mm
Phos-tag??预制胶,BioRad型
5块
192-18001 SuperSep??Phos-tag??(50μmol/l),?7.5%,?17well,?100×100×6.6mm
Phos-tag??预制胶,Life?Technologies型
5块
199-18011 SuperSep??Phos-tag??(50μmol/l),?12.5%,?17well,?100×100×6.6mm
Phos-tag??预制胶,Life?Technologies型
5块

Phos-tag? Biotin(生物素)

产品编号 生产商编号 产品名称 规格
301-93531 BTL-104 Phos-tag? Biotin BTL-104 10mg
308-97201 BTL-111S1 Phos-tag Biotin BTL-111 1mM Aqueous Solution 0.1ml

Phos-tag? Agarose(琼脂糖)

产品编号 生产商编号 产品名称 规格
302-93561 AG-501 Phos-tag? Agarose 0.5ml
308-93563 AG-503 Phos-tag? Agarose 3ml

Phos-tag? Mass Analytical Kit(质谱分析试剂盒)

产品编号 生产商编号 产品名称 规格
305-93551 MS-101KIT Phos-tag? Mass Analytical Kit 1 set

SuperSep Phos-tag? 预制胶即开即用!
phos-tag? 由日本广岛大学研究生院医齿药学综合研究科医药分子功能科学研究室开发。
SuperSep Phos-tag? 是一种预制胶,预先加入了50 μmol/L的Phos-tag? Acrylamide,打开包装即可直接使用。预制胶中含有锌作为金属离子,在中性凝胶缓冲液中保存稳定性很好,得到的结果条带也很整齐。

?板大小 ?100 x 100 x 3 (mm)
?凝胶大小 ?90 x 85 x 1 (mm)
?孔数 ?13 ?17
?孔容积 ?30 μL ?25 μL
?Phos-tag?浓度 ?50 μmol/L
?丙烯酰胺浓度 ?10%、12.5%、15% 和17%
?ZnCl2浓度 ?100 μmol/L

?

优点、特色
·即开即用
·预制胶使用安全
·可长期保存(6个月)
·操作与普通SDS-PAGE一样

◆案例、应用
电泳条件:30 mA(恒电流), 60分钟
样品:5 ug/Lane α-酪蛋白(含磷酸化与去磷酸化α-酪蛋白)(产品编号038-23221)
普通SDS-PAGE只观察到一条条带,而Phos-tag? SDS-PAGE里可见α-酪蛋白磷酸化和α-酪蛋白去磷酸化两条
条带。
样品缓冲液:Sample Buffer Solution (2ME+) (X4) (产品编号191-13272)
电泳缓冲液:SDS-PAGE 缓冲液, pH8.5(产品编号192-16801)
染色:QUICK CBB PLUS(产品编号174-00553)
P10%(左) : SuperSep Phos-tag? (50 μmol/L), 10%, 13well
P15%(中) : SuperSep Phos-tag? (50 μmol/L), 15%, 13well
A15%(右) : SuperSep?Ace, 15%, 13well (不含Phos-tag?)

◆相关产品

产品编号 产品名称 规  格
?058-07681 ?EasySeparator <配套电泳槽> ?1 套
?230-02461 ?Wide-View Prestained Protein Size Marker III (11~245kDa) ?500 μL (200 次)
?038-23221 ?α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated ?1 mg

◆具体实例

1. 体外激酶反应,激酶和底物都带有标签,反应后亲和层析法纯化获得激酶和底物,如何检测底物的磷酸化情况?

如果底物和激酶分子量差别大,通过正常的SDS-PAGE能够区分,建议使用Phos-tagTM Biotin。将激酶和底物进行免疫印迹实验,用Phos-tagTM Biotin作为抗体检测底物的磷酸化基团(需记录底物的条带位置)。可通过剥离(strip)方式剥离Phos-tagTM Biotin,用底物的非磷酸化抗体进一步验证其位置。

如果底物和激酶分子量差别不大,可进行Mn2+-Phos-tagTM SDS-PAGE实验,然后转膜,用底物的非磷酸化抗体检测(没有使用激酶的抗体,所以检测不到激酶的带)。在Mn2+-Phos-tagTM SDS-PAGE中磷酸化和非磷酸化底物发生分离,用底物的非磷酸化抗体可以检测所有底物。免疫印迹实验后,观察所有的条带,非磷酸化底物由于没有和Mn2+-Phos-tagTM Acrylamide结合,所以迁移速度较快,磷酸化底物则迁移速度变慢。通过迁移率的变化,分析磷酸化底物的含量。

备注:

1) Mn2+-Phos-tagTM SDS-PAGE实验中,建议使用α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated(038-

?????? 23221),该产品中含有磷酸化和非磷酸化的α-Casein,确保试剂和实验条件能够分离磷酸化蛋白。

2)如果没有非磷酸化底物,可使用Alkaline Phosphatase(for Biochemistry)(018-10693)对底物进行去磷酸

???? 化反应。

2. 如何检测EGF(表皮生长因子)刺激后细胞内MAPK的磷酸化水平?

收集EGF刺激的细胞,制备细胞裂解液作为样品。进行正常的SDS-PAGE实验和Mn2+-Phos-tagTM SDS-PAGE实验,转膜后用MAPK的非磷酸化抗体作为一抗进行检测(检测所有的MAPK,包括磷酸化和非磷酸化)。正常SDS-PAGE实验中,磷酸化的MAPK和非磷酸化MAPK没有分离,而在Mn2+-Phos-tagTM SDS-PAGE实验中磷酸化MAPK和非磷酸胡MAPK发生分离,所以转膜后,用MAPK抗体检测,可以看到分离的条带。比较正常的SDS-PAGE用MAPK抗体的免疫印迹实验和Mn2+-Phos-tagTM SDS-PAGE用MAOK抗体的免疫印迹实验,多出来的条带就是磷酸化的MAPK。

备注:该实验的前提是EGF刺激后细胞内的MAPK发生磷酸化,细胞内包含磷酸化和非磷酸化的MAPK。如果刺激后细

????????? 胞内不含有磷酸化的MAPK,则无法用Phos-tagTM Acrylamide分离磷酸化和非磷酸化MAPK。

3. 研究蛋白相互作用的实验中,构建带有不同标签的2种融合蛋白,共转染细胞,在细胞内发生磷酸化反应。通过不同标

??? 签的亲和层析柱获得纯化的蛋白,是否可用Phos-tagTM Agarose纯化,进行后续免疫共沉淀实验(Co-IP)实验?

Phos-tagTM Agarose纯化磷酸化蛋白,采用高盐的洗脱方式,没有使用界面活性剂、还原剂、酸或者碱洗脱,蛋白不发生变性,可进行后续的Co-IP实验。

4. 检测的样品中含有两种磷酸化的蛋白,分子量很接近,如何使用Phos-tagTM 产品检测磷酸化?

如果样品中两种磷酸化蛋白的分子量很接近,通过正常的SDS-PAGE实验无法区分,建议使用Phos-tagTMAcrylamide。进行Mn2+-Phos-tagTM SDS-PAGE实验后用两种蛋白的非磷酸化抗体进行检测。

也可以使用Phos-tagTM Biotin。进行正常SDS-PAGE实验后,先用两种蛋白的非磷酸化抗体进行检测,剥离(strip)后用Phos-tagTM Biotin。如果磷酸化蛋白量少的 话,剥离(strip)会去除一些蛋白,可能会影响检测的效果。

5. 使用Phos-tagTM Mass Analytical kit,样品中如果含有磷酸缓冲液是否有影响?

该试剂盒检测磷酸化蛋白和多肽的灵敏度较高,样品中含有的磷酸缓冲液会影响磷酸化蛋白与Phos-tagTM 结合。